北京2024年9月12日 /美通社/ -- 載體構(gòu)建是蛋白表達(dá)等很多實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)，也許你知道可以通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、調(diào)整表達(dá)載體、選擇合適的宿主細(xì)胞、控制培養(yǎng)條件等來(lái)提高蛋白表達(dá)量，但你是否關(guān)注過(guò)密碼子優(yōu)化這個(gè)關(guān)鍵步驟呢？當(dāng)遇到片段擴(kuò)增失敗，或載體難構(gòu)建的情況，也許你會(huì)不停優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、或更換試劑，你是否知道可以通過(guò)序列優(yōu)化增加載體構(gòu)建成功率呢？
在理解密碼子優(yōu)化的重要性之前，需先了解密碼子在基因表達(dá)中的作用。DNA序列通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而每個(gè)密碼子由三個(gè)核苷酸組成，指定一個(gè)特定的氨基酸。這種對(duì)應(yīng)關(guān)系在密碼子表中明確列出，例如，密碼子"ATG"編碼甲硫氨酸（Met），開(kāi)始蛋白質(zhì)的合成。苯丙氨酸（Phe）對(duì)應(yīng)的密碼子有UUU和UUC，而終止密碼子包括UAA、UAG和UGA。這種精確的編碼方式確保了蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和特異性?。
圖1.密碼子表
雖然不同的密碼子可編碼相同的氨基酸，但不同生物體對(duì)密碼子的使用存在偏好。這種偏好與每個(gè)生物體內(nèi)特定tRNA的豐度相關(guān)。基因表達(dá)水平與密碼子偏好性之間存在強(qiáng)相關(guān)性，同一氨基酸在不同宿主中，其對(duì)應(yīng)的密碼子會(huì)表現(xiàn)出不同程度的偏好[1]。因此，直接使用未優(yōu)化的基因序列可能導(dǎo)致外源基因在宿主，特別是異源宿主中的表達(dá)效率低下。
密碼子優(yōu)化（codon optimization）是在不改變基因編碼蛋白質(zhì)的前提下，通過(guò)調(diào)整基因編碼序列中的密碼子使用頻率，使用物種偏好密碼子并避免稀有密碼子得到優(yōu)化序列，來(lái)提高外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)水平的技術(shù)[2]。
對(duì)于自己構(gòu)建載體的客戶來(lái)說(shuō)，是無(wú)法進(jìn)行密碼子優(yōu)化的，因此采用基因合成方法來(lái)構(gòu)建載體就成為了首選。
序列優(yōu)化涉及更廣泛的序列調(diào)整，包括優(yōu)化GC含量、避免重復(fù)序列、消除不利的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等，目的是提高整個(gè)基因的穩(wěn)定性和表達(dá)效率，同時(shí)不改變最終編碼的氨基酸序列。
（1）密碼子偏好性
密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI是指異源mRNA序列中密碼子和宿主細(xì)胞最佳密碼子使用頻率相符合的程度，理論上此值越接近1，外源mRNA在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)越高，通常CAI＜0.8時(shí)，被認(rèn)為需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化。使用宿主細(xì)胞中使用頻率高的同義密碼子替換外源mRNA序列中的密碼子，例如，在大腸桿菌中，某些密碼子如TAA和TAG可能很少使用，而GCA（編碼丙氨酸）的使用頻率較高。且避免出現(xiàn)稀有密碼子，稀有密碼子可能導(dǎo)致翻譯停頓，增加翻譯時(shí)的錯(cuò)誤率，從而降低蛋白質(zhì)產(chǎn)量。同時(shí)考慮高頻和次高頻的密碼子組合。
注意CAI值過(guò)高可能導(dǎo)致外源基因在宿主細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而使得蛋白質(zhì)在合成過(guò)程中積累過(guò)快，無(wú)法正確折疊，從而形成包涵體。包涵體是指在細(xì)胞內(nèi)形成的不溶性蛋白質(zhì)聚集物，通常是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)未能正確折疊或是由于蛋白質(zhì)表達(dá)水平過(guò)高。適當(dāng)?shù)拿艽a子優(yōu)化可以幫助調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)速率，減少包涵體的形成，提高目標(biāo)蛋白的正確折疊和可溶性表達(dá)。
（2）GC含量
理想的GC含量通常在40%-60%之間。過(guò)高的GC含量可能導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)過(guò)于穩(wěn)定，過(guò)低則可能影響轉(zhuǎn)錄效率。
（3）mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)
復(fù)雜和穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響翻譯效率，特別是序列中有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯起始位點(diǎn)互作的序列，會(huì)阻止翻譯的進(jìn)行，合理優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，可提高蛋白表達(dá)水平。
擎科生物獨(dú)有的 GeneOptimizer 軟件密碼子優(yōu)化算法是不僅局限于密碼子層面的序列深度優(yōu)化技術(shù)。支持上萬(wàn)種宿主優(yōu)化和定制化服務(wù)。優(yōu)化的主要參數(shù)包括：密碼子偏好性、GC 含量、減少poly（A） 結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、酶切位點(diǎn)等。在保證密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI和GC含量處在合理范圍內(nèi)，盡可能減少其他負(fù)面因素的影響，求得帕累托最優(yōu)解，進(jìn)而完成對(duì)基因表達(dá)的優(yōu)化。擎科生物可為基因合成客戶提供免費(fèi)的密碼子及序列優(yōu)化服務(wù)。
通過(guò)自動(dòng)化序列分析評(píng)估軟件在不到一次眨眼的時(shí)間就能完成一個(gè)準(zhǔn)確的序列優(yōu)化（0.1s/個(gè)）。
擎科生物自主開(kāi)發(fā)的自動(dòng)化方案設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)載體和序列特點(diǎn)可批量設(shè)計(jì)多種高效構(gòu)建方案，提高載體構(gòu)建成功率。
案例分享：
（1）目標(biāo)蛋白16.8 kDa，密碼子優(yōu)化前蛋白不表達(dá)，密碼子優(yōu)化后蛋白大量表達(dá)。
（2）目標(biāo)蛋白100 kDa，密碼子優(yōu)化前包涵體表達(dá)，密碼子優(yōu)化后上清可溶表達(dá)75%。
[1] Sharp, P. M., & Li, W. H. (1987). "The Codon Adaptation Index—a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications." Nucleic Acids Research, 15(3), 1281-1295.
[2] Gustafsson, C., Govindarajan, S., & Minshull, J. (2004). "Codon bias and heterologous protein expression." Trends in Biotechnology, 22(7), 346-353.
